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《微生物的实验室培养》ppt课件人教版1

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专题2 :微生物的培养与应用
课题1 微生物的实验室培养

课题背景
? 19世纪中期,法国的酿造业遇到毁灭性的打击:葡 萄酒变酸、变味。引发了巴斯德等人的研究,发现 是发酵物中混入了杂菌,自此微生物学科开始快速 发展。
? 因此防止杂菌污染,获得纯净培养的微生物成了微 生物应用的关键。
到目前为止,几十项Nobel生理学和医学 奖,化学奖都与微生物学有关

? 那么在实验室培养微生物的关键技术是什么呢 ?
? 1.获得纯净的微生物,并确保其他微生物不 混入。
? 2.为微生物的生长提供适应的营养和环境条 件。

内容提要:
? 微生物特点及其分类 ? 培养基与各类营养物质 ? 无菌技术 ? 菌落 ? 大肠杆菌的纯化培养

1、课题目标: 了解有关培养基的基础知识,进行无
菌技术的操作,进行微生物的培养。
2.课题重点和难点:
无菌技术的操作。
3、技能目标:
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和 *板划线法等基本操作技术,熟练、规范 地进行无菌操作,成功地培养微生物。

一、微生物特点及分类
1、特点
结构都相当简单,个体多数十分微小, 通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到 ,有的甚至没有细胞结构。
2、类群

病毒(无细胞结构、寄生生活)

细菌
电子显微镜下的结核杆菌

放线菌

真菌

青霉菌

酵母菌

原生生物

病毒 细菌 放线菌
微生物包括哪五类: 真菌
原生动物

病毒界
原核生物界 真菌界 原生生物界

二、微生物的培养基
1.培养基概念 人们按照微生物对营养物质的不同需求,
配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.培养基的类型和用途 (1)按物理状态来分:培养基可分为固体培 养基、液体培养基和半固体培养基。其中固 体培养基用于菌种分离、鉴定等。 (2)按功能来分,可分为选择培养基和鉴别 培养基。 (3)按成分来分,可分为天然培养基和合成 培养基。

在液体培养基中加入一定量凝固剂,使其成 为固体状态,琼脂含量一般为1.5%-2.0%

固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴



固体培养基

定、活菌计数及菌种保藏





状 态

半固体培养基

琼脂含量一般为0.2%-0.7%

不 同

观察微生物的运动特征、分类鉴定





液体培养基

不加任何凝固剂

大规模工业生产

固体培养基:菌落

液体培养基:

表面生长

均匀混浊生长

沉淀生长

半固体培养基:

无动力

有动力(弥散)

(是否运动)

基础培养基

含有一般微生物生长繁殖所需的基本营 养物质的培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)









选择培养基







鉴别培养基

用来将某种或某类微生物从混杂的微生物 群体中分离出来的培养基
在培养基中加入相应的特殊营养物质或化 学物质,抑制不需要的微生物的生长,有
利于所需微生物的生长

用于鉴别不同类型微生物的培养基

微生物产生某种代谢产物,与培养基中的 特殊化学物质发生特定的化学反应,产生
明显的特征变化

延伸:
分离酵母菌、霉菌等真菌 分离金黄色葡萄球菌
分离固氮菌 分离自养型微生物 分离导入了目的基因的
受体细胞

鉴别培养基:
? 加入伊红美蓝琼脂培养基(EMS培养基) ? 鉴别大肠杆菌 ? 现象:蓝紫色金属光泽

化学成分不恒定的天然有机物

天然培养基 按

牛肉膏蛋白胨培养基、



麦芽汁培养基。用于工业生产





同 划

合成培养基

化学成分完全了解的物质配 制而成的培养基

分 用于分类和鉴定

4、培养基的营养构成
(1)碳源:凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元 素的营养物质都称为碳源 。
(2)氮源:凡是能为微生物提供所需氮元素的营 养物质都称为氮源。
(3)水:
(4)无机盐: (5)生长因子:微生物生长不可缺少的 微量有机 物质叫生长因子。包括维生素、氨基酸和碱基。

碳源功能和种类
C元素构成细胞中有机物的骨架 C元素是大多数微生物代谢所需的能量来源
无机碳源:CO2、碳酸盐。(只能被自养微生物利用) 有机碳源:各种糖类,其次是有机酸、醇类、 脂类和烃类化
合物 (异养微生物)
碳源是异养微生物的主要能源物质。

氮源功能和种类
为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料 1.分子态氮(氮气):固氮微生物的氮源 2.无机态氮(硝酸盐、铵盐):几乎所有微生物能
利用 3.有机态氮(蛋白质及其降解产物 ):
a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等 有机氮还能作为碳源和能源物质。

无机盐功能
构成微生物细胞的组成成分; 调解微生物细胞的渗透压, PH值; 有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源 构成酶活性基的组成成分,维持酶活性。如: Mg、Ca、K是多种酶的激活剂
Cncnc-micro


? 是细胞中生化反应的良好介质;营养物质和 代谢产物都必须溶解在水里,才能被吸收或排 出体(细胞)外。
? 水的比热高,能有效的吸收代谢过程中放出的 热量,不致使细胞的温度骤然上升。
? 维持细胞的膨压(控制细胞形态)。
Cncnc-micro

牛肉膏蛋白胨培养基 (应用最广泛和最普通的细菌基础培养基)
凝固剂 提供碳源、氮源、能源、生长因子
碳源、氮源、生长因子、能源 无机盐 水、溶剂
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方

4.培养基要满足微生物对环境条件的需求 :

pH:

真菌 细菌

微酸性(5.0-6.0) 中性(6.5-7.5)

放线菌

微碱性(7.5-8.5)

温度:
大多数微生物适宜生长的温度在25-40℃之间

氧气: 厌氧菌需提供无氧条件

培养基配制原则:
? (1)目的要明确:根据微生物的种类、培养 目的等确定配制培养基的种类,因为不同的微 生物对培养物质的需求不同。
? (2)营养要协调:注意各种营养物质的浓度 和比例。
? (3)pH要适宜:各种微生物适宜生长的pH范 围不同。
?

三、无菌技术
1.无菌技术的概念
无菌泛指在培养微生物的操作中,所有防止杂 菌污染的方法。
包括: 1.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 2.对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基进行灭菌。 3.避免实验操作过程中周围环境中微生物的污染。(超净 工作台、酒精灯火焰附*进行操作)(无菌操作) 4.避免将已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 (无菌操作)

2.消毒与灭菌
(1)消毒定义: 利用较为温和的物理或化学方法,杀死物体表
面或内部的部份微生物的过程。 常见消毒方法:附录5
①煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min ②巴氏消毒法:70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min ③化学药剂消毒法:用75%酒精等进行皮肤消毒,双氧水、碘 伏、碘*猩丝谙;氯气消毒水源。 ④紫外线消毒:利用紫外线能破坏微生物机体细胞中的DNA或RNA的
分子结构,造成生长性细胞死亡或再生性细胞死亡,达到杀菌消毒的效果。

(2)灭菌的定义:
是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物,包括所有细菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒, 而达到完全无菌的过程。
常见灭菌方法:灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭 菌

① 灼烧灭菌
接种环、接种针、试管口或瓶口

? ② 干热灭菌:160-170 ℃下加热1-2h。附录
4
? 能耐高温、需要保持干燥的物品。如玻璃器皿、金属用具

③ 高压蒸气灭菌:
100kPa、121 ℃下维持 15-30min. 最常用的灭菌方法,可 以杀灭所有的生物,包 括最耐热的某些微生物 的休眠体,同时可以基 本保持培养基的营养成 分不被破坏。 附录4

消毒与灭菌的比较

消毒方法
煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂(70%酒精等) 紫外线

针对不耐高温的液体 接种室、超净工作台 接种工具(接种环等) 培养皿等玻璃器皿

灭菌方法

实验操作者的双手

灼烧法 干热灭菌

实验操作者的衣服 培养基

高压蒸汽灭菌

能耐高温的,需要保持干燥的物品

旁栏思考:
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他 外来微生物污染外,还有什么目的?
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要,请选择合适的方法。
(1) 培养细菌用的培养基与培养皿 (2) 玻棒、试管、烧瓶和吸管 (3) 实验操作者的双手
(1)、(2)需要灭菌;(3)需要消毒。

3.微生物实验室培养的基本操作程序
1、器具的灭菌(干热灭菌) 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌(高压蒸汽灭菌) 4、倒*板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存

四、大肠杆菌的分离和纯化培养
(一)培养基的配置 (二)纯化大肠杆菌

1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)计算、称量(配制固体培养基要加入琼脂) (2)溶化 (3)调pH(可以用盐酸或氢氧化钠调) (4)分装、包扎 (5)灭菌(高压蒸汽灭菌) (6)倒*板(操作步骤及注意事项) (7)无菌检查:放于恒温箱中培养,检查灭菌是否彻底。

倒*板操作
1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上,右手拿锥形瓶, 左手拔棉塞。 2.右手拿锥形瓶,使瓶口迅速通过火焰。 3.用左手打开培养皿一条稍大于瓶口的缝隙,右手将锥形瓶 中的培养基倒入培养皿。倒完后,立即盖上培养皿盖。 4.待培养皿中的培养基冷却凝固(5-10分钟)后,将*板倒 置安放。
倒完*板后放于37度恒温箱中培养12-24h,观察是否长出菌 落,检查灭菌是否彻底。

1.培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时, 才能用来倒*板。你用什么办法来估计培养基的 温度?
答:可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶, 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可 以进行倒*板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?
答:通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染 培养基。

3.*板冷凝后,为什么要将*板倒置?
答:*板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,将* 板倒置,既可以防止皿盖上的水珠落入培养基, 造成污染,又可以避免培养基的水分过快地挥发。
4.在倒*板的过程中,如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位,这个*板还能用来 培养微生物吗?为什么?
答:空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生,因此最好不要用这个*板 培养微生物。

(二)纯化大肠杆菌
原理:设法在培养基上获得由一个细胞繁殖而来的肉 眼可见的菌落。
菌落是指单个或少数细菌在固体培养基上大量 繁殖时,就会形成一个肉眼可见的,具有一定形态 结构的子细胞群体 菌落是鉴定菌种的重要依据。

菌落
细菌的菌落特征 因种而异

菌落
霉菌的菌落 特征
因种而异

2.接种方法: ⑴*板划线法 (2)稀释涂布*板法

交叉划线法

连续划线法

1.将接种环放在
火焰上灼烧,直
到接种环烧__红_____

2.在火__焰_____旁
冷却接种环, 并打开棉塞

3.将试管口通过火焰

7.灼烧接种环,待其冷却后,
从第一区域划线的末__端_____开
始往第二区域内划线。重复以 上操作,在三、四、五区域内 划线。注意不要将最后一区的 划线与第一区相连。

8.将*板_倒__置__
放入培养箱中培 养。

4.将已冷__却____的接种环
伸入菌液中蘸取一环菌 液

5.将试管通过火
焰,并塞上棉塞

6.左手将皿盖打开一条缝隙,右 手将沾有菌种的接种环迅速伸入
*板内,划三___至__五_____条*行线,
盖上皿盖。注意不要划破培养基。

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然需 要灼烧接种环吗?为什么?
答:(1)操作的第一步灼烧接种环是为了 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物; (2)每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划 线结束后接种环上残留的菌种,使下一次划线时, 接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。 (从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种 的数目逐渐减少,以便得到单个菌落。) (3)划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种 环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作 者。

2.在灼烧接种环之后,为什么要等其 冷却后再进行划线?
答:以免接种环温度太高,杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时, 为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线 条起始处要少,使细菌的数目随着划线次数 的增加而逐步减少,最终获得由单个细菌繁 殖而来的菌落。

⑵稀释涂布*板法: a.梯度稀释菌液: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

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菌液

6支试管,分别加入9ml无菌水

b.涂布*坂
? 取0.1ml菌悬液
微量 移液器

涂布*板的所有操作都应在火焰附* 进行。结合*板划线与系列稀释的无菌 操作要求,想一想,第2步应如何进行无 菌操作?
应从操作的各个细节保证“无菌”。 例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、 吸管头不要接触任何其他物体、吸管要 在酒精灯火焰周围等等。

3、微生物的恒温培养
将接种后的培养基和一个未接种的培养基,放 入37℃恒温箱中倒置培养12h-24h,直到长出菌落为 止。

微生物的恒温培养 微生物的恒温培养

结果分析与评价
? 1.未接种的培养基表面是否有菌落生长?若有,说明什么? 一般没有。若有则说明培养基感染了杂菌。
? 2.在接种了大肠杆菌的培养基上,是否观察到了独立的菌落 ,这些菌落的颜色、形状和大小相似吗?
? 是,相似。(若在培养基上加入伊红-美兰,可以观察到菌落 呈深紫色,并有金属光泽。)
? 3.培养12h和24h后,观察到的实验结果相同吗?为什么? ? 不同。24h的更密集 ? 4.若在培养基上观察到了不同形态的菌落,分析可能是哪些
原因造成的? ? 感染了杂菌。可能是操作不规范,灭菌不彻底。

微生物的恒温培养

菌种的保存
1、临时保藏: 接种到固体斜面培 养基,菌落长成后 置于4℃冰箱保存。
2、长期保存: 甘油冷冻管藏法

本课题知识小结:

【典例解析】

答案:D

例1.关微生物营养物质的叙述中,正确的是 A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量

解析:不同的微生物,所需营养物质有较大差别,要 针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项,它的表达是 不完整的。有的碳源只能是碳源,如二氧化碳;有的碳源可 同时是氮源,如NH4HCO3;有的碳源同时是能源,如葡 萄糖;有的碳源同时是氮源,也是能源,如蛋白胨。对于C 选项,除水以外的无机物种类繁多,功能也多样。如二氧化 碳,可作为自养型微生物的碳源;NaHCO3,可作为自养 型微生物的碳源和无机盐;而NaCl则只能提供无机盐。对 于D选项,无机氮源提供能量的情况还是存在的,如NH3可 为硝化细菌提供能量和氮源。

例2.下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是

A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌

C.培养基和发酵设备都必须灭菌

D.灭菌必须在接种前

答案:B

解析:灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A 说的是灭菌的目的,因为发酵所用的菌种大多是单一 的纯种,整个发酵过程不能混入其他微生物(杂菌), 所以是A正确的;B是错误的,因为灭菌的目的是防止 杂菌污染,但实际操作中不可能只消灭杂菌,而是消 灭全部微生物。C是正确的,因为与发酵有关的所有设 备和物质都要灭菌;发酵所用的微生物是灭菌后专门 接种的,灭菌必须在接种前,如果接种后再灭菌就会 把所接菌种也杀死。

例3.右表是某微生物 培养基成分,请据此回答:
(1)右表培养基可培 养的微生物类型
是 自养型微生物。 (2)若不慎将过量 NaCl加入培养基中。 如不想浪费此培养基, 可再加入 含碳有机,物用来 培养金黄色葡萄球菌。

(3)若除去成分②,加入(CH2O),该培

养基可用于培养 固氮微生物



(4)表中营养成分共有 3 类。

(5)不论何种培养基,在各种成分都溶化后

分装前,要进行的是 调节pH 。

(6)右表中各成分重量确定的原则



依微生物的生长需要确定 。

(7)若右表培养基用于菌种鉴定,应该增加

的成分是 琼脂(或凝固剂) 。

每个人的心灵深处都有着只有他自己 理解的 东西。 对具有高度自觉与深邃透彻的心灵的 人来说 ,痛苦 与烦恼 是他必 备的气 质。 在一切创造物中间没有比人的心灵更 美、更 好的东 西了。 唯有心灵能使人高贵。所有那些自命 高贵而 没有高 贵的心 灵的人 ,都像 块污泥 。 一个人只要他有纯洁的心灵,无愁无 恨,他 的青春 时期, 定可因 此而延 长。 能充实心灵的东西,乃是闪烁着星星 的苍穹 ,以及 我内心 的道德 律。 你的心灵常常是战场。在这个战场上 ,你的 理性与 判断和 你的热 情与嗜 欲开战 。 无所事事并非宁静,心灵的空洞就是 心灵的 痛苦。




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